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| 猪釉基质蛋白的提取及N末端氨基酸序列分析 |
| 来源： 时间：2007-04-24 10:12:09 |
目的：从猪牙胚提取釉基质蛋白并做氨基酸测序，为进一步研究釉基质蛋白诱导牙周组织再生的生物活性奠定基础。方法：选择乙酸提取法获得釉基质蛋白，采用SDS-PAGE电泳和印迹膜测序法分析N末端氨基酸序列。结果：提取的釉基质蛋白分子量条带主要位于20KDa以下，优势条带为20KDa、13KDa、5KDa。20KDa、5KDa釉基质蛋白N末端前10个氨基酸残基均为：Met、Pro、Leu、Pro、Pro、His、Pro、Gly、His、Pro。结论：乙酸提取法可获得典型的釉原蛋白。印迹膜测序法简易、快速、敏感。
关键词 猪 釉基质蛋白 SDS-PAGE氨基酸序列 自1975年Slavkin和Boyde首次提出，来自赫特威氏上皮根鞘(HERS)的釉质相关蛋白诱导了牙齿根部无细胞性牙骨质的形成以来，釉基质蛋白在诱导牙周组织再生方面的作用日益受到牙周病学者的关注，并开始对釉基质蛋白的生物活性进行了探索。部分研究报告显示，釉基质蛋白不仅可诱导与根部牙本质紧密附着的无细胞性牙骨质的形成，还可诱导牙周韧带和牙槽骨的再生，而且这种再生类似这些组织的正常发育过程［1］。为了探索釉质蛋白诱导牙周组织再生的机制，本实验首先对猪牙胚釉基质蛋白进行了提取和分离，并对主要分子量条带的N末端氨基酸序列进行了分析。材料和方法 一、釉基质蛋白的提取［2，3］ 1.选择6月龄新猪颌骨标本，用外科手术方法将埋于上、下颌骨内的恒牙胚取出，-70℃低温保存备用。 2.将牙胚标本解冻后，以生理盐水清洗净牙胚表面的软组织，用手术刀片仔细分离奶酪样牙釉基质。获得的牙釉基质标本置于0.5M乙酸中，缓慢摇动，4℃条件下过夜。 3.乙酸提取液中加入20%三氯乙酸静置孵育15min，然后在4℃、12000转/分(Hettich Universal 16/16R德国)离心15min，使蛋白质沉淀。弃上清液，加丙酮溶液清洗沉淀物，再在4℃、12000转/分下离心5min后彻底去净丙酮。沉淀物加双蒸水溶解后冻干保存备用。 二、蛋白质聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)［4］ 1.配制15%分离胶，5%浓缩胶。 2.取冻干保存的釉基质蛋白，配制100mg/100ml浓度的蛋白溶液，吸取240μl加等量样品处理液。选用低分子量标准蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司)进行对照(Marker)。两种蛋白样品均在100℃下水浴5min，自然冷却后上样，上样量如附图。附图 猪牙胚釉基质蛋白SDS-PAGE电泳结果
M：Marker(97.4-14.4KDa) 余条带均为釉基质蛋白，
上样量为40～80μl < 3.开启电源开关，浓缩胶电压50V，分离胶70V，待溴酚蓝指示剂达凝胶底部边缘时即停止电泳，剥胶，考马斯亮兰R250染色，脱色。 三、氨基酸序列分析——印迹膜测序法［5］ 1.将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质条带通过电转移技术，转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidine diluoride PVDF)膜上，考马斯亮兰R250染色，50%甲醇脱色［4］。 2.分别剪下PVDF膜上分子量为20KDa、5KDa的蛋白质条带，在BECKMAN LF3200/多肽氨基酸序列测定仪上进行N末端氨基酸序列分析。结 果 一、SDS-PAGE 猪牙胚釉基质经乙酸提取后，SDS-PAGE电泳结果如附图，显示分子量条带主要位于20KDa以下，优势条带为20KDa、13KDa、5KDa，为典型的釉原蛋白。
二、氨基酸序列分析
将釉基质蛋白分子量为20KDa、5KDa的PVDF膜进行N末端氨基酸序列分析，结果表明，两个分子量条带的N末端10个氨基酸残基均为Met(甲硫氨酸)、Pro(脯氨酸)、Leu(亮氨酸)、Pro、Pro、His(组氨酸)、Pro、Gly(甘氨酸)、His、Pro。讨 论 在牙周新附着的愈合模式中，牙骨质的再生，重新包埋新生的牙周韧带-夏柏氏纤维是牙周组织再生的重要一环。因此，釉基质蛋白诱导无细胞性牙骨质，乃至牙周韧带、牙槽骨再生的生物活性作用为促进牙周组织的重建展示了光明的前景。釉质蛋白分为釉原蛋白(amelogenin)和釉蛋白(enamelin)两类。在发育期釉质中蛋白含量较多，且绝大多数为釉原蛋白。而在成熟矿化的釉质中，蛋白含量低，釉原蛋白逐渐消失，主要含釉蛋白。所以，釉质蛋白诱导牙周组织再生的作用主要由釉基质蛋白即釉原蛋白产生。不同的蛋白质提取方法可获得不同分子量的釉质蛋白。本实验采用0.5M乙酸法提取釉基质蛋白。为了鉴定所获得的蛋白质的性质，我们采用SDS-PAGE电泳及氨基酸序列分析的方法。SDS-PAGE电泳结果显示，其分子量条带主要分布于20KDa以下，优势条带为20KDa、15KDa、5KDa，为典型的釉原蛋白，与国外报道一致［3，6］。获得的釉基质蛋白20KDa、5KDa N末端10个氨基酸残基序列分析结果表明，不仅这两种分子量的氨基酸序列完全相同，而且与Yeh报道的人牙胚23KDa和Finchm报道的牛牙胚5KDa釉原蛋白的氨基酸序列前10个残基完全一致。我们的实验结果不仅证明了所获得的釉基质蛋白的可靠性，也进一步证实了釉质蛋白在同属种类之间的遗传保守性［2，7］。氨基酸序列的测定，是鉴定蛋白质性质的首选方法之一。按照传统的方法，如要进行蛋白质氨基酸测序，须将蛋白质SDS-PAGE电泳分离后再经高效液相层析(HPLC)技术纯化，收取单一分量峰值蛋白质，才可测定。HPLC设备复杂，纯化过程需较多的样品量，且整个过程蛋白质丢失较多。我们在本实验中采用Kennedy等介绍的印迹膜测序法这一新技术，将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质条带通过电转移技术直接转移至PVDF膜，分别剪取膜上各蛋白质条带直接用于氨基酸序列分析，取得满意结果。这项技术简便、快速、可靠、敏感，所需样品量少。
众所周知，釉质蛋白分子量和氨基酸组成存在不均一性，即多样性，含有多种分子量。综合一些研究结果发现，不同分子量的釉原蛋白，其氨基酸序列是非常接近的。Hammarstrom、Gestrelins等学者进行的釉基质蛋白诱导牙周组织再生实验研究均采用多分子量混合的釉基质蛋白［8～10］。 我们的实验结果显示所提取的是釉基质蛋白。所获得的蛋白其诱导牙周组织再生的生物活性究竟如何，我们将在以后的实验中继续探讨。 |
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