摘 要：目的 检测地塞米松诱发NIH小鼠先天性腭裂时对表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法 在GD1212天小时给怀孕小鼠腹腔注射磷酸地塞米松注射液(50mg/kg)，对照组则以等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时取出胎鼠头部标本，作冠状位切片。采用免疫组化方法检测胚胎腭中EGFR的表达。结果 EGFR的表达随胚胎腭的发育而增高，实验组EGFR增高的速度较慢。结论 地塞米松诱发先天性腭裂发病与EGFR表达的改变有关。
先天性腭裂是口腔颌面部常见的先天性畸形，发病率高。尽管在临床上对于这种发育畸形的序列治疗已日趋完善，但该病发病机理尚不清楚。
胚胎腭的发生发育是一系列连续、复杂的生物学过程，在这一系列复杂的过程中，需要激素、第二信使、生长因子等参与生命活动信号的传递。Brunet等发现［1］，体外培养的腭器官中，125I-EGF的结合位点广泛存在，并随着腭器官的发育而发生时空性改变。Abbott和Shiota曾报道表皮生长因子受体(EGFR)在胚胎腭发育过程不同时期会发生改变［2，3］。这些结果提示EGFR在胚胎腭发育中具有重要作用。本研究采用免疫组化方法检测胚胎腭发育过程中EGFR的表达变化以及地塞米松对其表达的影响，探讨EGFR在小鼠胚胎腭发育及先天性腭裂发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
6～8周龄体重25～30g雌性NIH小鼠60只，随机分为对照组及实验组，每组30只。兔抗小鼠EGFR抗体，Boster公司产品。S-P免疫组化染色试剂盒，Santa公司产品。DAB显色试剂盒，Santa公司产品。
1.2 标本制备
经与雄鼠交配后，如发现阴栓，认为雌鼠已受孕，记为GD00天小时(gestation day，GD)。实验组在GD1212天小时腹腔注射磷酸地塞米松(50mg/kg)［4］，对照组以同等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时颈椎脱位处死母鼠，每组各为5只，剖腹取出胎鼠，切取胎鼠头部。标本经4%多聚甲醛固定24h后，序列酒精脱水，石蜡包埋。以麦克尔氏软骨为基准面，作冠状位4～5μm厚连续切片，H-E染色，脱水，封片，光镜观察。
1.3 免疫组化染色
用S-P方法进行免疫组化染色，主要步骤如下：切片脱蜡至水，置3%H2O2中浸泡10min以消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清37°C孵育20min以降低非特异性着色。适当稀释的兔抗小鼠EGFR抗体37°C孵育2h，生物素化的二抗作用20min，三抗作用20min，DAB显色3min，苏木素复染。以购自北京中山公司的阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 图像处理
光镜观察染色结果，选取阳性染色切片经电视摄像系统输入HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像细胞测量系统分析，每个时期各选10个视野。
2 结 果
2.1 光镜观察
GD1312天小时对照组及实验组胚胎舌体位置较高，腭突位于舌体两侧向下垂直生长。GD1412天小时对照组舌体降至口底，腭突上抬至舌体上方呈水平相对生长，部分腭突相互接触，中间嵴上皮在中线区形成上皮中缝。实验组腭突位于舌体两侧开始上抬。GD1512天小时对照组腭突接触融合，上皮中缝消失，间充质细胞相互连接形成完整的腭器官。实验组腭突在舌体上方呈水平生长，但体积较小，不能在中线区相互接触，腭裂形成(图1)。
2.2 免疫组化染色
EGFR着色位于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色。在胚胎腭中主要表达于上皮成份中，间充质中有散在表达(图2)。
2.3 地塞米松对胚胎腭上皮细胞中EGFR表达的影响
免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，将其平均光度值记录如附表。
2.4 地塞米松对胚胎腭间充质细胞中EGFR表达的影响
结果见附表。免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，取平均光度值记录如图3。
图1 实验组GD1512天小时腭突体积较小，形成HC样裂 H-E×33
图2 实验组GD1512天小时腭突EGFR表达方式SP×66
附表 地塞米松诱发先天性腭裂对EGFR表达的影响
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口腔面上皮 |
腭突中嵴上皮 |
鼻腔面上皮 |
| 1312 |
对照组 |
0.022±0.004 |
0.022±0.009 |
0.026±0.007 |
| (n=10) |
实验组 |
0.023±0.008 |
0.024±0.007 |
0.024±0.003 |
| 1412 |
对照组 |
0.137±0.042 |
0.143±0.019 |
0.121±0.025 |
| (n=10) |
实验组 |
0.064±0.009* |
0.046±0.014* |
0.058±0.013* |
| 1512 |
对照组 |
0.172±0.027 |
- |
0.191±0.053 |
| (n=10) |
实验组 |
0.184±0.033 |
0.179±0.024 |
0.171±0.031 |
*与对照组相比P<0.05
图3 地塞米松诱发性腭裂对间充质表达EGFR的影响
3 讨 论
先天性腭裂是由遗传和环境因素综合作用而引起的先天性发育畸形，其中环境因素尤其是化学物质与其发生密切相关。目前已发现不少药物如糖皮质激素类、维生素A类、TCDD等均可诱发先天性腭裂，其中地塞米松致畸率高［5］，致畸引起的腭突体积小、上抬延迟并不能在中线区相互接触融合，从而形成HC样裂。这与临床常见的先天性腭裂在形态学上较相似，因而我们在本研究中采用地塞米松作为致畸药物。
EGFR是一种单跨膜糖蛋白，分子质量为170kD，其胞外部分可以结合表皮生长因子(EGF)，胞内部分能与ATP结合。当EGFR胞外部分与其配体相互结合后，致酪氨酸酸激酸活化，引起受体酪氨酸发生磷酸化，胞外信号由此向细胞内传递并扩大，从而启动胞核内有关基因，促进细胞增殖。虽然表皮生长因子可以在体外培养过程中促进鼠胚胎腭中间嵴上皮(MEE)和间充质细胞(MEPM)的增殖［6，7］，但这一作用最终仍需EGFR的参与。Shiota报道［2］，在胚胎发育过程中，小鼠胚胎腭口腔面上皮及中间嵴上皮均可表达EGFR，并随着发育而出现时间性和空间性的改变。这一发现提示EGFR可能参与胚胎腭发育的调节过程。我们在实验中发现，在胚胎腭的发育早期(GD1312天小时)，对照组与正常组胚胎腭EGFR的表达无明显差别；在胚胎形成时期(GD1412天小时)，对照组腭突发育充分，其中表达的EGFR明显要高(P<0.05)；到了腭器官形成以后(GD1512天小时)，EGFR在实验组MEE仍有较高的表达，但在间充质中表达较对照组低(P<0.05)。结合形态学分析，EGFR的表达异常可能与实验组小腭突的形成及MEE的持续存在有关。
TCDD作用于怀孕早期的母体可以诱发TCDD样裂，其腭突可充分发育并上抬至水平位相互接触，但并不发生融合。以TCDD作用于体外培养的胚胎腭突，尽管其中EGF含量降低，但MEE仍表达较高的EGFR并持续增殖［8］。这说明EGFR在胚胎腭发育形成过程中，不仅可以促使MEPM细胞的增殖，还可能抑制胚胎腭发育过程中MEE细胞的程序性死亡。由于EGFR表达水平较高，尽管腭突可以相互接触，但MEE细胞仍保持完整，从而腭突无法相互融器官。
在胚胎发育过程中，有多种物质参与了生命调节活动。本研究发现地塞米松诱发先天性腭裂可能与EGFR异常表达相关，同时尚有TGFβ的改变，因此先天性腭裂的确切发病机理尚有待于进一步深入的研究。
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